تبلیغات
***** BEINA * SOFT ***** - کشت انواع قارچ (تکنیک های تولید و کشت آگار)

***********

تکنیک های تولید و کشت آگار

هوایی كه از آن تنفس می‌كنیم مملو از موجودات بسیار ریز است كه با باد به حركت درمی‌آیند. قارچ‌ها، باكتریها، ویروسها و گیاهان برای انتقال گرده‌های خود به مناطق دیگر از باد كمك می‌گیرند. در صورت عدم رعایت نكات بهداشتی، این ذرات می‌توانند چه در تهیه كشت خالص و چه در فرآیند تولید قارچ خوراكی خلل وارد نمایند.

به طور كلی منابع اصلی آلاینده محیط كشت عبارتند از

1. محیط اطراف

2. ظروف كشت

3. ادوات و ابزار کشت

4. پرورش دهنده و لباس وی

5. هاگ‌ها یا میسلیوم قارچ خوراكی

 

قارچ‌ها و تمامی موجودات زنده نسبت به مواد غذایی، رقابت تنگاتنگ و دائمی با یكدیگر دارند. هدف از ایجاد یك محیط استریل، حذف یا كاهش این گونه رقابت و در نهایت فراهم ساختن شرایط مناسب برای تكثیر قارچ خوراكی می‌باشد. اولین مرحله قبل از تهیه كشت خالص، احداث اطاقک تلقیح یا آزمایشگاه استریل است.

طراحی و احداث آزمایشگاه استریل

علت عمده شكست بیشتر پرورش‌دهندگان قارچ، عدم صرف وقت كافی به منظور احداث آزمایشگاه استریل است. كاری كه چندان هم وقت و انرژی نمی‌برد، بلكه فقط یك و نیم روز كافی است تا یك انباری كوچك یا یك آبدارخانه را به یك اطاقک تلقیح مفید تبدیل نمود.

برای شروع تمام قالیچه‌ها، پتوها، پرده‌ها و دیگر مواد پارچه‌ای را كه پناهگاه خوبی برای گرد و غبار و هاگ‌های مضر می باشند از محل دور كرده و تمامی دیوارها و سقف را با یك ماده ضد عفونی كننده كاملاً تمیز نمائید. اطاق را با یك رنگ روغنی براق یا اپوكسی بهداشتی رنگ زده تا شستشو‌های بعدی راحت‌تر گردد. پنجره‌ها یا هر منبع ورودی هوا را با یك پوشش پلاستیكی مناسب بپوشانید. محل ورودی اطاق را با پلاستیك یا هر ماده دیگر بصورت یك محفظه انتظار درآورده تا مانع جریان مستقیم هوا بدرون اطاق گردد و طراحی این محفظه باید به گونه‌ای باشد كه هنگام ورود به آن؛ درب آزمایشگاه بسته باشد.

تجهیزات ذیل در هر آزمایشگاه ضروری است:

1- صندلی و میز محكم با سطح كاملاً صاف

2- چراغ الكلی، چراغ بنسن[i][i][i] یا یك شعله معمولی گاز بوتان برای تولید حرارت

3- بطری اسپری حاوی محلول سفید كننده 10 درصد

4- تعدادی پتری دیش استریل و لوله آزمایش

5- تعدادی برچسب ، یك دفتر و خودكار

6- یك چاقوی آگار و حلقه تلقیح[ii][ii][ii]

7- یك دستگاه اتوكلاو یا زودپز معمولی (بخار تحت فشار)

8- pH  سنج یا كاغذ تورنسل معمولی

9- الكل 96 درصد و دیگر مواد ضد عفونی همچون وایتكس، فرمالین

10- قفسه برای ظروف كشت، جالوله‌ای و

 

تمامی این اجزاء بایستی درون آزمایشگاه بماند و در صورت خروج یكی از آنها به بیرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمایشگاه باید از تمیز بودن آن، مطمئن شد.

به طور كلی برای طراحی یك آزمایشگاه باید علاوه بر تجهیزات و وسایل گفته شده اصول زیر نیز درنظر گرفته شود.

—      اطاق تهیه محیط كشت كه دارای تجهیزات كامل و قفسه‌های متعدد است (35 درصد مساحت كل)

—      اطاقك شیشه‌ای استریل (محفظه تلقیح)(15 درصد مساحت كل)

—      اتاق كشت (40 درصد مساحت كل)

—      الباقی مساحت برای نگهداری وسایل، اتوكلاو، ترازوها، یخچال و انبار میسلیوم

 و اسپان مادری (حدوداً 10 درصد)

 

با روش ساده‌ای می‌توان آزمایشگاه یا محیطی نیمه استریل بسته به حجم استفاده و دفعات كاری ایجاد نمود. درصد پاكی لازم برای اطاق استریل تابع مقدار هاگ محیط بیرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاینده‌های هوا تا حد زیادی كاهش یافته، حال آن كه در طول تابستان و بهار این مقدار بسیار زیاد می‌باشد. بنابراین لازم است در طی این دو فصل توجه كافی به استریل بودن محیط آزمایشگاه مبذول گردد. نكته مهم دیگر این كه، تمامی ظروف و بطری‌های شیشه‌ای آلوده را باید به طریقی از بین برد تا ضریب آلودگی محیط آزمایشگاه به حداقل برسد.

بعد از احداث اطاق استریل باید یك سری اصول و نكات بهداشتی را كاملاً رعایت نمود. به این صورت كه اطاق استریل را باید با یك محلول سفیدكننده (آب ژاول) كاملاً تمیز نمود؛ كف را طی كشیده و در پایان هوای اطاق را با یك محلول سفید كننده 10 درصد و با استفاده از یك سمپاشی پشتی یا اسپری ضدعفونی نمائیم. حداقل تا 15 دقیقه بعد از محلول پاشی نباید وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقیح و كشت این عملیات باید تكرار شود، چرا كه همواره پیشگیری آسانتر و بهتر از درمان است.

پیش از ادامه بحث، ذكر چند نكته ضروری است. استریل نمودن و استریل نگاه داشتن محیط مستلزم توجه زیاد همراه با كمك و یاری مداوم دیگران است. این امر وقت‌گیر بوده و نباید سرسری و مقطعی انجام گیرد. هرگز یك چراغ الكلی یا شعله گاز را درون اطاق یا محفظه تلقیح روشن نگذارید، چرا كه در یك محیط بسته اكسیژن هوا به زودی تمام می‌شود.

بعضی از پرورش‌دهندگان، بیش از نیاز لازم بهداشتی با آلودگی مقابله می‌نمایند. بدین ترتیب این افراد آزمایشگاه و در نهایت سلامتی خود را با مصرف وسواسی و افراطی قارچ‌كشها، باكتری‌كشها و ضدعفونی كننده‌های شیمیائی جهش‌زای خطرناك به خطر می‌اندازند. به طور مثال می‌توان به عوارضی همچون تنگی نفس، بی‌حسی‌های شدید همراه با تشنج‌های مداوم كه گاه تا چندین روز نیز به درازا می‌انجامد كه بر اثر كار طولانی مدت افراد، بلافاصله در اطاق‌هائی كه مدت چندانی (كمتر از 15 دقیقه) از سمپاشی آنها بالاخص با سموم فنلی نگذشته اشاره كرد و یا از بین موارد متعدد دیگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولانی (چند سال) و مستقیم پوست (بدون پوشش ایمنی) با اشعه ماورای بنفش (uv) در حین استریل كردن نمونه‌ها داخل محفظه شیشه‌ای[iii][iii][iii] درون اطاق تلقیح اشاره نمود.

چنانچه علیرغم تلاش فراوان در جهت استریل نمودن محیط آلودگی باز هم در محیط باقی بماند در آن صورت می‌توان از راه‌كارهای ذیل استفاده نمود.

1. بخوردادن روغن استریل‌كننده مانند تری‌اتیلن گلایکول با‌گرم‌كن‌فتیله‌ای در‌فضای اطاق كه ابری از قطرات بسیار ریز و نسبتاً سنگین در هوا ایجاد شده كه ضمن پائین آمدن ذرات آلاینده معلق در هوا را جذب كرده و از بین می‌برند. ذرات این روغن نسبتاً ریز و فرار بوده و هیچ گونه لایه قابل مشاهده‌ای در فضا ایجاد نمی‌نماید. این روش ارزان و آسان می‌باشد.

2. احداث نوعی محفظه شیشه‌ای كاملاً مسدود و نیمه استریل برای نقل و انتقال و كارهای كشت بافت كه می‌توان آنها را از چوب و پنجره‌ای كوچك برای نگاه كردن درون آن ساخت كه در یك طرف آن دو سوراخ لاستیكی مخصوص تعبیه می‌نمایند تا هنگام كار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه كرده و در صورت عدم استفاده، ورودی سوراخ‌ها با لفافه‌ای پوشیده می‌شود. مزیت عمده این محفظه ارزان، بودن استریل كردن آسان محیط داخل آن و عدم جریان مستقیم هوا به درون آن در ضمن كار می‌باشد.

3. استفاده از صافی‌های بسیار ریز كه قطر چشمه‌های آن 3/0-1/0 میكرون بوده و از قطر هاگهای مضر بعضی قارچ‌ها و حتی از باكتری‌ها نیز كوچكتر است. از این صافی‌ها در سامانه‌های مخصوصی بنام هود تهویه ملایم استفاده می‌نمایند. در برخی از آزمایشگاه‌های پیشرفته تمام استریل، درون دیوارها یا سقف نیز از این نوع صافی‌ها استفاده شده و هوای ورودی اطاق با عبور از میان آنها تصفیه می‌شود.

برای كسب اطلاعات بیشتر به ضمیمه چهارم مراجعه شود

آلودگی، ممكن است در یك محل كم و در جای دیگر زیاد باشد و یا در یك مرحله از پرورش طغیان نماید یا این كه علی‌رغم چند سال فعالیت، اثری از آن دیده نشود. از طرفی باید توجه داشت كه نوع آلودگی، در مراحل و مكان‌های مختلف یكسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به یك سری عوامل مختلف داخلی یا محیطی متفاوت است كه با اعمال یك سری تمهیدات و اصول بهداشتی تا حدی می‌توان آن را كنترل نمود.

آماده کردن محیط کشت

پس از تكمیل آزمایشگاه نوبت به تهیه محیط كشت مغذی آگار می‌رسد. آگار، محصولی است كه از نوعی جلبك دریایی بدست آمده و برای سفت كردن محیط كشت بكار می‌رود و از نظر ظاهری بسیار شبیه ژلاتین است اما از نظر كاركرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمینه تولید محیط كشت آگار غنی شده كه مناسب قارچ‌های خوراكی باشد، فرمول‌های متعددی وجود دارد كه از این میان می‌توان به فرمول‌های استاندارد PDA  [iv][iv][iv]وMEA   [v][v][v]همراه با مكمل خمیرمایه[vi][vi][vi] اشاره نمود. در بسیاری از مجلات قارچ شناسی، فهرستی از انواع محیط‌های كشت آگار حاوی پپتن[vii][vii][vii] و نئوپپتن[viii][viii][viii] (دو منبع سرشار از پروتئین مورد نیاز میسلیوم) ارائه شده است. محیط كشتی كه مؤلفان توصیه می‌نمایند، مخلوطی از دانه‌های جوشانده شده گندم یا چاودار غنی شده با شیره مالت است. برای افزایش رشد می‌توان به محیط كشت زایلوز و 1- آرابینوز (از قندهای پنج كربنه پنتوزی متبلور) اضافه كرد. از جمله مواد لازم دیگر برای محیط كشت می‌توان كلسیم، بیوتین، تیامین[ix][ix][ix]، اسیدهای آمینه اسپاراژین، آلانین و گلایزین را نام برد.

آنچه در ادامه‌ می‌بینید سه نوع فرمول مغذی آگار است كه هر كدام از آنها برای رشد میسلیومهای انواع مختلف قارچ خوراكی همچون دكمه‌ای، صدفی، شی‌تاكه، استروفاریا، چینی، پانالوس و سیلوسب استفاده می‌شود كه از بین آنها؛ 2 محیط PDY[x][x][x]  و MPG[xi][xi][xi] مورد توجه مؤلفان این كتاب می‌باشند. توصیه می‌شود برای افزایش رشد میسلیوم‌ها به هر محیط، مقداری پودر چاودار و یا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر یك از فرمول‌های زیر تركیبات آن را بصورت خشك با هم مخلوط كرده، درون یك فلاسك ریخته و درنهایت با افزودن آب، حجم مخلوط را به یك لیتر برسانید.

الف) آگار PDY (مخمر دكستروز سیب‌زمینی)

ـ عصاره صاف شده 300 گرم خلال سیب‌زمینی كه در یك لیتر آب تا یك ساعت جوشیده باشد.

ـ 10 گرم قند (گلوكز راست گرد) (قند دکستروز)

ـ 2 گرم مخمر (اختیاری)

- 20 گرم آگار

ب) آگار MPG (مخلوط بذرـ پپتین ـ مالت)

ـ 20 گرم مالت عسلی رنگ[xii][xii][xii]

ـ 5 گرم پودر بذر چاودار

ـ 5 گرم پپتین یا نئوپپتن

ـ 2 گرم مخمر (اختیاری)

ـ 20 گرم آگار

ج) آگار MEA (آگار عصاره مالت)

ـ 20 گرم مالت عسلی رنگ

ـ 2 گرم مخمر

ـ 20 گرم آگار

در تهیه محیط كشت، رعایت نكات زیر ضروری است

1. pH محیط كشت: گونه‌های متفاوت قارچ برای رشد و نمو در محیط كشت، pH خاص خود را می‌طلبند. بطوری كه pH مطلوب برای گونه‌های سیلوب 7-6 می‌باشد؛ در حالی كه این مقدار برای نوع دکمه‌ای 7-5/6 می‌باشد. اكثر گونه‌ها، نسبتاً مقاوم بوده و بخوبی در دامنه 5/7 5/5 رشد می‌نمایند. pH كمتر از 5/4 و بالاتر از 7 باعث توقف رشد و نمو (هاگ‌‌‌‌‌ها و میسلیومها) می‌گردد و چنانچه pH محیط خیلی پائین باشد. محیط كشت رقیق می‌شود و باید محیط تازه با pH مطلوب آماده شود. pH ، بعد از اتوكلاو كردن تا 4/0 واحد كاهش می‌یابد.

چنانچه در حین تهیه محیط كشت، pH خیلی پائین یا بالا رود، می‌توان بترتیب آن را با Naoh یا Hcl (1 تا 1/0 مولار) رقیق، تعدیل كرده سپس محیط كشت را كاملاً هم زده و سپس pH آن را با یك pH سنج یا كاغذ تورنسل معمولی می‌سنجیم ( pH یك مول Hcl ، صفر؛ یك مول Naoh =12 و یك مول آب مقطر= 7 است).

2.ضدعفونی محیط كشت: این كار معمولاً به دو روش صورت می‌گیرد.

الف: با مواد شیمیائی: مانند الكل 70درصد؛ هیپوكلریت سدیم (وایتكس) 1درصد و بالاخص آنتی‌بیوتیكها. در هر صورت ساده‌ترین راه، استفاده از مواد گیاهی غیر آلوده است. جهت كنترل باكتریها در محیط كشت، 1/0 گرم از محلول سولفات جنتامایسین 80-60درصد را قبل از عمل اتوكلاو كردن باید به هر لیتر از این محیط‌ها اضافه نمود. همچنین می‌توان از نوع دیگر آنتی‌بیوتیك بنام استرپتومایسین بعد از استریل كردن محیط كشت استفاده كرد. در مجموع باید از آنتی‌بیوتیكها بصورت موقتی و به مقدار بسیار اندك بهره جست چون غلظت بالای آنها، مانع رشد و نمو بعضی گونه‌ها و از طرف دیگر ایجاد مقاومت در باكتریها می‌شود.

ب) با بخار: بعد از اختلاط كامل تركیبات محیط كشت و در صورت باقی ماندن اثرات باكتری بعد از ضدعفونیِ شیمیائی (آنتی‌بیوتیكها) می‌توان برای رفع هر گونه آلودگی با بخار تحت فشار، محیط كشت را استریل و یا به اصطلاح اتوكلاو نمود. استریل كردن صحیح، بستگی به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استریل دارد. در شرایط عادی می‌توان محیط كشت آماده را داخل ارلن پیركس (به علت دهانه تنگ آن میزان تهویه، خشك شدن و ضریب آلودگی كاهش می‌یابد) ریخته درب آن را با یك فویل آلومینیومی پوشاند. دقت كنید كه حجم آگار درون ارلن نباید از  تا  حجم كل ظرف بیشتر شود.

ظرف كشت را داخل اتوكلاو یا زودپز معمولی[xiii][xiii][xiii] قرار داده و ته زود‌پز را یك سانتی‌متر آب مقطر بریزید تا بخار لازم تأمین شود. طبق دستورالعمل شركت سازنده، درب زودپز را كاملاً بسته آن را حرارت دهید تا بخار فراوان تولید نماید. قبل از بستن سوپاپ اطمینان بخار، بگذارید تا بخار آن به مدت 4 تا 5 دقیقه خارج شود. به آرامی فشار را به 15 پوند[xiv][xiv][xiv] رسانده و 30 دقیقه در همین فشار نگهدارید. توجه كنید دمای ظرف از 121 درجه سانتی گراد فراتر نرود، چه در غیر این صورت قند موجود در محیط كشت، سوخته و به اصطلاح كارامل می‌شود كه در نتیجه آن؛ رشد میسلیوم متوقف شده، یكسری جهش‌های ناخواسته ژنتیكی پدیدار می‌شود. از طرفی اتوكلاو كردن بیش از 30 دقیقه باعث ته‌نشین شدن املاح مفید (بخصوص k+ ) و تجزیه آگار می‌شود. هم چنین باید ظروف خالی شیشه‌ای و كاغذها را بطور جداگانه به مدت 30 دقیقه در دمای 130 سانتی‌گراد (بصورت خشك) استریل نمود.

نكته حائز اهمیت دیگر در مورد اتوكلاو كردن، این كه زمان لازم برای این عمل بسته به ارتفاع از سطح دریا، متفاوت است. طبق قانون بویل ـ ماریوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقیمی با یكدیگر دارند. فشار هوا را معمولاً نسبت به سطح استاندارد دریا محاسبه ‌نموده و هر چه از سطح دریا بالاتر می‌رویم فشار هوا كمتر می‌شود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دریا، باید فشار اتوكلاو یا زودپز را افزایش دهیم تا خللی در عمل استریلیزاسیون وارد نشود. ذیلاً نسبت‌های بین پارامترهای دما، فشار هوا، و تغییرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذیل می‌بینید. بعنوان مثال در ارتفاع حدوداً 1500 متری از سطح دریا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دریا تقریباً 5/4 -5 درجه سانتی‌گراد كاهش می‌یابد (C˚95) و از طرفی در این ارتفاع؛ فشار هوا 5 پوند یا تقریباً 4/0 اتمسفر نسبت به سطح دریا افزایش می‌یابد (4/1 اتمسفر) در نتیجه با توجه با این كه نباید دمای داخل اتوكلاو را (به سبب بروز تغییرات شیمیائی مواد داخل آن) افزایش دهیم، بناچار مجبوریم، فشار را به میزان 4/0 آتمسفر (5 پوند) بالا ببریم تا جبران 5 اختلاف دما را در این ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوكلاو بنماید.

 


رابطه ارتفاع و نقطه جوش

رابطه فشار- دما در حجم ثابت

نقطه جوش

ارتفاع ازسطح دریا(متر)

فشارKg/cm2

(سانتی گراد)

دما

100

در سطح دریا

07/0

100

99

307

2/0

104

98

619

3/0

108

97

5/934

7/0

115

96

1250

=1atm05/1

121

95

1567

5/1

126

93

1892

75/1

130

 

توجه كنید استریلیزاسیون در فشار 05/1 kg/cm2 به مدت یك ساعت دارای نتایج مشابهی با استریلیزاسیون در فشار kg/cm22 به مدت 30 دقیقه (یعنی دوبرابر كردن فشار و نصف كردن مدت زمان) دارد؛ منتها مسأله مهم در این جا این است كه اكثر زودپزها تحمل این فشار را ندارند كه باید حتماً قبل از استفاده به برچسب كنترل كیفی روی هر زودپز توجه شود.

بعد از اتمام استریل كردن؛ زودپز را در آزمایشگاه یا یك اطاق نیمه استریل قرار داده، اجازه دهید تا قبل از باز كردن درب آن، فشار به یك پوند (07/0kg/cm2) كاهش یابد. سپس درب آن را باز نمائید و اقدام به ریختن آگار در پتری دیش‌ها نمائید. باید دانست با هر لیتر از محلول آگار بدست آمده می‌توان 30 پتری دیش 15×100 میلی‌متر را پر نمود. چنانچه با محدودیت فضای میزكار مواجه هستید، می‌توانید پتری دیش‌ها را پس از پر نمودن یك به یك روی هم بگذارید اما در‌ غیر این صورت می‌توانید هر یك از پتری دیش‌ها را در كنار هم قرار دهید و دامنه كار خود را توسعه دهید .

 

پیش از پر نمودن پتری دیش‌ها، محلول كشت را به شدت تكان دهید تا محتویات آن خوب پخش شده مخلوطی همگن بدست آید. سپس بگذارید تا آگار خنك شده و یكنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتری دیش‌ها نمائید تا بدین وسیله از تعریق جدار داخلی ظروف كه از ریختن محلول آگار گرم ناشی می‌شود، جلوگیری شود.

حال، این محلول آماده كشت هاگ یا بافت زنده می‌باشد كه در ادامه روش آنرا خواهیم دید.

كشت هاگ[xv]

كشت خالص به منظور تهیه اسپان مورد نیاز برای تكثیر قارچ خوراكی را به دو روش می‌توان تهیه نمود. كشت هاگ، كه به نوعی می‌توان آن را تكثیر جنسی نامید و دارای تفریق صفات و تنوع بالای نتاج حاصله از نظر كیفیت و كمیت محصول می‌باشد. از این روش بیشتر برای تهیه بذر قارچ استفاده می‌شود. روش دوم كشت بافت زنده[xvi] یا به اصطلاح تكثیر غیرجنسیxvii] و یا كلونینگxviii] می‌باشد. این روش به علت شباهت بالای نتاج تولیدی با والدین؛ بیشتر در تكثیر قارچ‌هائی كه از نظر كیفیت و كمیت محصول در حد مطلوبی هستند استفاده می‌شود.

پرورش دهندگان قارچ، كشت هاگ را بدلیل راحتی اجرا و ماندگاری بالای هاگ‌ها حتی تا ماهها بعد از تجزیه کلاهکها ترجیح می‌دهند. اما ماندگاری كلاهكها یا بافت زنده بسیار كم است (1 تا 2 روز) و باید بلافاصله بعد از چیدن بافت، اقدام به كشت نمود.

گرفتن نقش هاگ[xix]

مرحله اول در كشت هاگ؛ جمع‌آوری مقداری هاگ (نقش اسپور) از قارچ‌های سالم و مناسب می‌باشد. بدین منظور كلاهك سالم، تازه و كاملاً تمیزی را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روی یك كاغذ سفید یا سطح شیشه‌ای تمیز (اسلاید میكروسكوپ) یك تا دو ساعت می‌گذاریم. چنان‌چه كلاهك موردنظر خشك باشد، جهت رهاسازی آسانتر هاگ یكی دو قطره آب مقطر به آن زده و برای جلوگیری از كاهش تبخیر و جریان هوای مستقیم، یك بشر بر روی آن می‌گذاریم. پس از چند ساعت كه هاگ‌ها، كاملاً رها شد و نقش تیغه‌ها روی كاغذ افتاد؛ كاغذ هاگ‌ها را بریده از وسط تا می‌زنیم و دریك ظرف كاملاً در بسته گذاشته وروی آن را بر چسبی حاوی زمان جمع‌آوری؛ گونه قارچ و شماره جمع‌آوری می‌زنیم. در صورت جمع‌آوری هاگ‌ها روی لامل میكروسكوپ، كافیست هاگ‌ها را ما بین دو لامل قرار داده دور تا دور لبه این دو لامل را با نوار چسب بچسبانیم تا از نفوذ هاگ‌های آلاینده، ایمن شود. در صورتی كه در جمع‌آوری و نگهداری هاگ‌ها دقت كافی نشود، محیط كشت هاگ آلوده شده و امكان به دست آوردن یك كشت خالص كاهش می‌یابد.

مجله اینترنتی دانستنی ها ، عکس عاشقانه جدید ، اس ام اس های عاشقانه